四種蛋白含量測定方法（雙縮脲法、BCA法、Lowry法，考馬斯亮藍法）

 蛋白質是一切活細胞和有機體(ti) 的最重要和最必需的組成成分，它是構成人體(ti) 及所有動物機體(ti) 組織幹物質的主要部分。例如，人體(ti) 按總量計算，幹重54％是蛋白質，即除去水分後，蛋白質約占體(ti) 重的一半左右，可見蛋白質是生命活動中最重要的物質基礎。

       蛋白質是由二十種氨基酸以肽鍵相互聯接而成的複雜的高分子化合物，它水解的最終產(chan) 物是氨基酸。在蛋白質分子內(nei) 又通過氫鍵、鹽鍵、疏水作用力構成蛋白質的空間結構，即蛋白質的構象（ conformation )。當蛋白質分子受到某些物理、化學因素影響時，它的空間結構就會(hui) 發生改變或破壞，物理化學性質和生物學性質也隨著發生變化，稱為(wei) 蛋白質的變性作用。因此在研究蛋白質的生物學功能時，應防止它的變性作用。

       蛋白質在溶液中的分子大小，溶解度，電荷，吸附性質和對其他分子的親(qin) 和力等各不相同，根據這些因素，可以選擇一定的方法分離，製備和鑒定蛋白質。利用蛋白質肽鏈末端基的特點，還可以設計特殊的分析技術來測定蛋白質的一級結構。

       氨基酸是構成蛋白質的基本單位，它也是生物體(ti) 維持生長所必需的營養(yang) 物質，具有特殊的生理作用，參與(yu) 生物機體(ti) 的代謝。因此對氨基酸的分離測定在實際工作中也是重要的。

       蛋白質含量可從(cong) 它們(men) 的物理化學性質，如折射率、比重，紫外吸收、染色等測定而得知；或用化學方法，如定氮、雙縮脲反應、 folin﹣酚試劑反應、BCA法等方法來測定。其中 Folin ﹣酚試劑法和考馬斯亮藍染色法是一般實驗室中經常使用的方法。而 Folin﹣酚試劑法靈敏度較高，較紫外吸收法靈敏10~20倍，而較雙縮脲法靈敏100倍左右。這類方法操作簡便、迅速，不需要複雜和昂貴的設備，又能適合一般實驗室的要求，若作一般測定較為(wei) 適宜。

       一、雙縮脲法

       1.原理

        在堿性溶液中蛋白質與(yu) Cu2+形成紫紅色絡合物，其顏色的深淺與(yu) 蛋白質的含量成正比，而與(yu) 蛋白質的相對分子質量及氨基酸成分無關(guan) ，故可用來測定蛋白質含量。測定範圍1~10mg蛋白質。

        雙縮脲法常用於(yu) 需要快速但並不需要十分精確的測定。硫酸銨不幹擾此呈色反應，使其有利於(yu) 對蛋白質純化早期步驟的測定。

        幹擾此測定的物質包括在性質上是氨基酸或肽的緩衝(chong) 劑，例如 Tris 緩衝(chong) 液，因為(wei) 它們(men) 給予陽性呈色反應。Cu2+也容易被還原，有時發現出現紅色沉澱。

       2.試劑和器材

         ①試劑

    標準酪蛋白溶液（10mg/mL)：酪蛋自要預先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度稱量配製成標準溶液。用0.05mol/L 氫氧化鈉溶液配製。亦可用10mg/ mL 牛血清清蛋白溶液。

       雙縮脲試劑：取1.50g硫酸銅（CuSO4•5H2O）和6.0g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O )，用500mL水溶解，在攪拌下加入300mL10％氫氧化鈉溶液，用水稀釋到1000mL，貯存於(yu) 塑料瓶中（或內(nei) 壁塗以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉澱出現，則需重新配製。

       ②器材

         分光光度計，恒溫水浴

       3．操作方法

        標準曲線的製定：取12隻試管分成兩(liang) 組，分別加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL的標準酪蛋白溶液，用水補足到1mL，然後各加入4mL雙縮脲試劑，充分搖勻後，在室溫下（20~25℃）放置30分鍾，於(yu) 540nm處進行比色測定。取兩(liang) 組測定的平均值，以酪蛋白的含量為(wei) 橫坐標，光吸收值為(wei) 縱坐標繪製標準曲線，作為(wei) 定量的依據。

        用同樣的方法測定未知樣品，注意樣品濃度每ml不要超過10mg，否則要適當稀釋。

       二、Folin﹣酚試劑法（Lowry法）

         1.原理

         用於(yu) 蛋白質測定的 Lowry 反應是雙縮脲方法的發展，第一步涉及到在堿性溶液中銅﹣蛋白質複合物的形成，然後這個(ge) 複合物還原磷鉬酸﹣磷鎢酸試劑（Folin氏試劑），產(chan) 生深藍色（鉬藍和鎢藍混合物）。這個(ge) 測定法較雙縮脲法靈敏得多。對雙縮脲反應發生幹擾的離子同樣容易幹擾Lowry反應，而且對後者的影響還要大得多。所測蛋白質樣品中若含酚類及檸檬酸均有幹擾作用。濃度較低的尿素（約0.5％左右）、胍（0.5％左右）、硫酸鈉（1%)、硝酸鈉(1%)、三氯乙SUAN（0.5%)、乙醇（5%)、乙MI（5%)、丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，這些物質濃度高時必須做校正曲線。含硫酸銨的溶液隻須加濃碳酸鈉﹣氫氧化鈉溶液即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色後色淺，則必須提高碳酸鈉﹣氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。

         進行測定時，加 Folin 氏試劑要特別小心，因為(wei) Folin 氏試劑僅(jin) 在酸性pH 條件下穩定，但上述還原反應隻是在pH10的情況下發生，故當Folin氏試劑加到堿性的銅﹣蛋白質溶液中時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸﹣磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應即能發生。

此法也適用於(yu) 酪氨SUAN和色氨SUAN的定量測定。

       2.操作方法

    2.1樣品測定

           取1ml樣品溶液（約含20-250ug多肽或蛋白質），加入5ml試劑甲，混勻，於(yu) 20~25℃保溫30分鍾，然後於(yu) 500nm處比色。以1ml水樣替代品作為(wei) 空白對照。

       2.2標準曲線的製定

           取14隻試管分成兩(liang) 組，分別加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL標準蛋白溶液（250ug/ml），用水補足到1mL，然後按上述方法進行操作，測定光吸收值。取兩(liang) 組測定的平均值，以蛋白質濃度為(wei) 橫坐標，光吸收值為(wei) 縱坐標，繪製標準曲線作為(wei) 定量的依據。

          若用0.5cm光程的比色池進行比色，可按下麵方法進行操作：取0.2ml樣品溶液（約含5~100ug多肽或蛋白質），加入1ml試劑甲（可選用0.3cm~0.5cm直徑的小試管），混勻，10分鍾後再加0.1ml試劑乙，立即搖勻，30分鍾後比色。若多肽或蛋白質濃度在5~25ug，則波長用755nm，25ug以上則采用500nm比色為(wei) 宜。

       3.試劑和器材

          3.1試劑

1. 標準蛋白質溶液：可用結晶牛血清清蛋白或酪蛋白，預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度配製成250ug/ml的溶液。

2. Folin-酚試劑的配製（均用分析純試劑）：

    試劑甲：由下述4種溶液配製的。（1）4％碳酸鈉（ Na2CO3）溶液；（2）0.2mol/L 氫氧化鈉溶液；（3）1％硫酸銅（ CuSO4•5H2O ）溶液；（4）2％酒石酸鉀鈉溶液（或酒石酸鉀、酒石酸鈉）。在使用前，將（1）與(yu) （2）等體(ti) 積混合配成碳酸鈉﹣氫氧化鈉溶液，將（3）與(yu) （4）等體(ti) 積混合配成硫酸銅﹣酒石酸鉀鈉溶液。然後將這兩(liang) 種溶液按50:1的比例混合，即為(wei) Folin﹣酚試劑甲。該試劑隻能用一天，過期失效。

          試劑乙（ Folin 氏試劑）：市售福林酚試劑

       3.2器材

          分光光度計    恒溫水浴

       三、考馬斯亮藍染色法（Bradford法）

         1.原理

          1976年 Bradford 建立了用考馬斯亮藍 G -250與(yu) 蛋白質結合的原理，迅速、敏感的定量測定蛋白質的方法。染料與(yu) 蛋白質結合後引起染料最大吸收的改變，從(cong) 465nm變為(wei) 595nm，光吸收增加。蛋白質﹣染料複合物具有高的消光係數，因此大大提高了蛋白質測定的靈敏度，檢出量為(wei) 1ug蛋白。染料與(yu) 蛋白質的結合是很迅速的過程，大約隻需2分鍾，結合物的顏色在1小時內(nei) 是穩定的。一些陽離子，如 K+ , Na+, Mg2+ ,( NH4)2SO4，乙醇等物質不幹擾測定，而大量的去汙劑如 TritonX -100, SDS 等嚴(yan) 重幹擾測定，少量的去汙劑可通過用適當的對照而消除。以下試劑對考馬斯亮藍 G -250-蛋白質複合物有影響：1mol/LKCL、5mol/NaCL、1mol/LMgCL2、2mol/LTris、0.1mol/LEDTA、1mol/L(NH4)2SO4、99%乙醇、5%酚、丙酮、0.1%TritonX-100、1%TritonX-100、0.1%SDS、1%SDS。由於(yu) 染色法簡單迅速，靈敏度高，現已廣泛應用於(yu) 蛋白質含量的測定。

       2.操作方法

    2.1標準方法

     取含10~100ug蛋白質溶液於(yu) 小試管中，用雙蒸水或緩衝(chong) 液調體(ti) 積到0.1mL ，然後加入5mL蛋白試劑，充分振蕩混合，2分鍾後於(yu) 595nm測定光吸收值。以0.1mL 雙蒸水或緩衝(chong) 液及5mL 蛋白試劑作為(wei) 空白對照。

       2.2微量蛋白分析法

     取含1~10ug蛋白質溶液，用雙蒸水調體(ti) 積到0.8mL，加0.2mL蛋白試劑，充分振蕩混合，2分鍾後於(yu) 595nm測定光吸收值，以0.8mL雙蒸水及0.2mL蛋白試劑作為(wei) 空白對照。

     用不同濃度的蛋白質溶液作標準曲線，以蛋白濃度為(wei) 橫坐標，光吸收值為(wei) 縱坐標，繪製標準曲線作為(wei) 定量的依據。

       3.試劑和器材

    試劑

1. 標準蛋白質溶液：可用牛血清清蛋白預先經微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，根據其純度配製成1mg/ mL 的溶液。或根據牛血清清蛋白的紫外消光係數 A1% 1cm＝6.6來確定。

2. 蛋白試劑的配製：稱取100mg考馬斯亮藍G-250溶於(yu) 50ml95%乙醇，加入100ml85%（W/V）磷酸，將溶液用水稀釋到1000ml。試劑的終濃度為(wei) 0101%考馬斯亮藍G-250，4.7%（W/V）乙醇，和8.5%（W/V）磷酸。

   器材

         分光光度計     微量注射器

       四、BCA法

          1.產(chan) 品描述

             BCA（Bicinchonininc Acid）蛋白含量檢測法是用於(yu) 總蛋白質定量的常用方法，BCA 與(yu) 二價(jia) 銅離 子混合即為(wei) BCA 工作液，蛋白在堿性條件下能夠將 Cu2+還原為(wei) Cu+，Cu+與(yu) BCA 試劑可形成紫色絡 合物，產(chan) 物在 562 nm 處具有特征吸收峰，通過吸光值變化即可定量檢測樣品的蛋白濃度。

          2.注意事項

            ①Copper Solution 與(yu) PBS Diluent 可置於(yu) 2-8℃長期保存，若發現汙染渾濁則應丟(diu) 棄；BCA Solution 在低溫條件下出現結晶沉澱時，可 37℃溫育使其*溶解，不影響使用；

            ②為(wei) 了您的安全和健康，請穿實驗服並戴一次性手套操作；

            ③BCA 法測定蛋白含量不受絕大部分樣品中化學物質的影響，樣品中 5% SDS、5% Triton X-100、 5% Tween20、60、80 等常用濃度去垢劑不影響檢測結果，但 EDTA 和 EGTA 等螯合劑、DTT 和巰基 乙醇等還原劑和脂類會(hui) 影響檢測結果，需確保 EDTA 低於(yu) 10 mM、無 EGTA、二硫蘇糖醇低於(yu) 1 mM、 巰基乙醇低於(yu) 0.01%；若樣品含有較多幹擾物質且本身背景值較高，建議使用 Bradford 法蛋白含量檢測試劑盒（Cat AKPR015）；

            ④若蛋白濃度較低時（小於(yu) 50 μg/mL），可將顯色溫度提高至 60℃且待測樣本

與(yu) 工作液比例調整 為(wei) 1:8 進行測定，能夠明顯提高靈敏度至 5 μg/mL；

            ⑤為(wei) 保證結果準確且避免試劑損失，測定前請仔細閱讀說明書(shu) （以實際收到說明書(shu) 內(nei) 容為(wei) 準）， 確認試劑儲(chu) 存和準備是否充分，操作步驟是否清楚，且務必取 2-3個(ge) 預期差異較大的樣本進行預測定，過程中問題請您及時與(yu) 工作人員聯係。