核黃素（維生素B2）熒光光度定量測定法

 一、目的

       1.了解熒光法測定核黃素的原理和方法

       2.學習(xi) 熒光光度計的操作和使用

       3.掌握熒光定量分析工作曲線

二、原理

       核黃素（維生素B2)是一種異咯嗪衍生物，其水及乙醇的中性溶液為(wei) 黃色，並且有很強的熒光，這種熒光在強酸和強堿中易被破壞。核黃素可被亞(ya) 硫酸鹽還原成無色的二氫化物，同時失去熒光，因而樣品的熒光背景可以被測定。二氫化物在空氣中易重新氧化，恢複其熒光，

三、實驗器材

       1.核黃素片（5mg/片）

       2.熒光光度計

       3.容量瓶100ml（*2）

       4.試管1.5cm*15cm（*7）

       5.吸管10.0ml（*1），5.0ml（*1），2.0ml（*1），0.50ml（*2）

       6.量筒1000ml（*1），100ml（*1）

四、實驗試劑

       1．核黃素標準溶液：準確稱取核黃素10mg，放入預先裝有約50ml蒸餾水的1000ml容量瓶中，加入 5ml 6mol/ L 乙酸，再加入大約800ml水，置水浴中避光加熱直至溶解，冷卻至室溫，用蒸餾水定容至1000ml，混勻。

       2．連二亞(ya) 硫酸鈉（保險粉）或亞(ya) 硫酸鈉。

       3.  36％乙酸。

五、操作

    1．標準曲線繪製

       將配好的10ug/ ml 標準核黃素溶液，按表50所示比例稀釋成六個(ge) 標準溶液。

    2．樣品溶液的配製

       將被測的樣品（如核黃素藥片、維生素 B 針劑等）參照標準溶液的含量範圍和溶劑體(ti) 係配製成測定溶液。對於(yu) 食物和生物材料中的核黃素測定，一定需要事先經過抽提，或經過分離，純化處理。

    3．熒光測定

       參照附錄六中熒光光度計的使用說明，選用濾色片，核黃素熒光測定的激發光波長為(wei) 460nm，發射光波長為(wei) 520nm。因此可選用帶迪型400nm（藍色）濾色片為(wei) 激發光濾色片，選用截止型510nm（紅色）濾色片為(wei) 發射光濾色片。待儀(yi) 器預熱並調好零點後，用0號標準溶液（2.5ug/ ml ）作為(wei) 參比溶液調熒光光度計的熒光強度讀數到滿刻度（100%)，分別測定其他標準溶液和樣品溶液的相對熒光強度，在測定中如果樣品溶液的熒光強度超出100％則需要再行稀釋，在每一個(ge) 測定溶液測定完後，需要重新倒回到相應的試管內(nei) 。

    4,  數據處理

       每一個(ge) 測定溶液的熒光強度讀數矯正公式為(wei) ：F=F1+F2

       式中 F：校正後的熒光強度；

               F1：未還原時測得的熒光強度：

               F2：還原後測得的熒光強度。

       以標準溶液校正後的熒光強度為(wei) 縱坐標，相應的含量為(wei) 橫坐標，作出核黃素測定的標準曲線。將樣品溶液校正後的熒光強度在工作曲線上查出相應的含量。

六、注意事項

       在所有操作過程中，要避免核黃素受陽光直接照射。